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1、 加样：分别设标准孔、待测样品孔、空白孔。设标准孔7孔，依次加入100μL不同浓度的标准品(见试剂准备2)。空白孔加100μL(见试剂准备第二步最后一管)，余孔加待测样品100μL，酶标板加上覆膜，37oC温育2小时。
2、 弃去液体，甩干，不用洗涤。
3、 每孔加检测溶液A工作液100μL(临用前配制)，酶标板加上覆膜，37oC温育1小时。
4、 弃去孔内液体，每孔用350μL的洗涤液洗涤，浸泡1-2分钟，吸去(不可触及板壁)或甩掉酶标板内的液体，在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次(也可轻拍将孔内液体拍干)，重复洗板3次。最后一次洗涤后，要把孔内的洗涤液完全甩干。自动洗板机亦可。
5、 每孔加检测溶液B工作液(临用前配制)100μL，加上覆膜，37oC温育30分钟。
6、 弃去孔内液体，甩干，洗板5次，方法同步骤4。
7、 每孔加底物溶液90μL，酶标板加上覆膜，37oC避光显色(反应时间控制在15-25分钟，不要超过30分钟。当标准孔的前3-4孔有明显的梯度蓝色，后3-4孔梯度不明显时，即可终止)。
8、 每孔加终止溶液50μL，终止反应，此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物溶液的加入顺序相同。如出现颜色不匀一，请轻轻晃动酶标板以使溶液混合均匀。
9、 在确保酶标板底无水滴及孔内无气泡后，立即用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度(O.D.值)。
注意：
1、 试剂准备：准备一次实验所需要的酶标条，其它的可从微孔板上拆下，密封，按照说明书要求保存，以备下次使用。
2、 加样：实验操作中请使用一次性的吸头，避免交叉污染。加样时注意不要有气泡，将样品加于酶标板底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。加样或加试剂时，第一个孔与最后一个孔加样之间的时间间隔如果太大，将会导致不同的“预温育”时间，从而明显地影响到测量值的准确性及重复性。因此，一次加样时间(包括标准品及所有样品)最好控制在10分钟内。推荐设置复孔进行实验。
3、 温育：为防止样品蒸发，实验时请将加上盖或覆膜的酶标板置于湿盒内，以避免液体蒸发，洗板后应尽快进行下步操作，任何时侯都应避免酶标板处于干燥状态，同时应严格遵守给定的温育时间和温度。
4、 洗涤：充分的洗涤非常重要，在每次洗涤过程中，都要将洗涤液完全甩干。洗涤过程中反应孔中残留的洗涤液应在滤纸上拍干，勿将滤纸直接放入反应孔中吸水，同时要消除板底残留的液体和手指印，避免影响最后的酶标仪读数。如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实 验过程中。
5、 反应时间的控制：加入底物后请定时观察反应孔的颜色变化(比如，每隔10分钟观察一次)，如颜色较深，请提前加入终止液终止反应，避免反应过强从而影响酶标仪光密度读数。
6、 底物：底物请避光保存，在储存和温育时避免强光直接照射。
7、 如果实验室内湿度低于60%，推荐使用加湿器提高湿度水平。
